การพัฒนาวิธีการตรวจจีโนไทป์ของ HPA-21 ด้วยเทคนิค PCR-SSP

Abstract

ข้อมูลพื้นฐานและวัตถุประสงค์: แอนติเจนของเกล็ดเลือด หรือ Human platelet antigen (HPA) ปัจจุบันมีทั้งหมด 29 ระบบ HPA-21 เป็นระบบที่พบว่ามีความสำคัญทางคลินิค พบความถี่ของอัลลีลสูงในเอเชีย และยังไม่เคยศึกษาความถี่ของอัลลีลในไทย งานวิจัยนี้ได้พัฒนาวิธีการตรวจโดยทำการทดลองหาสภาวะที่เหมาะสม สำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในส่วนที่จำเพาะกับอัลลีลระบบ HPA-21 ในหลอดทดลอง ตรวจหาความเข้มข้นที่เหมาะสมของ HPA-21b แบบสังเคราะห์เพื่อนำมาใช้เป็นตัวอย่างควบคุม และทดลองใช้ตรวจหาจีโนไทป์ของอัลลีลระบบ HPA-21 ในตัวอย่างดีเอ็นเอของผู้บริจาคเกล็ดโลหิตของศูนย์บริการโลหิต สภากาชาดไทย วิธีการทดลอง: หาสภาวะที่เหมาะสมของการตรวจหาจีโนไทป์ของยีน HPA-21 ด้วยวิธี Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer (PCR-SSP) และหาความเข้มข้นที่เหมาะสมของ HPA-21b control ที่สังเคราะห์ขึ้น ตรวจหาจีโนไทป์ของอัลลีลระบบ HPA-21 โดยใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอของผู้บริจาคเกล็ดโลหิตของศูนย์บริการโลหิต 100 ตัวอย่าง ผลการทดลอง: สภาวะที่เหมาะสมในการตรวจหาจีโนไทป์ระบบ HPA-21 ความเข้มข้นของไพรเมอร์ HPA-21 คือ 2.4 µm ของ HGH คือ 6.1 µm อุณหภูมิช่วง annealing ที่เหมาะสมคือ 67 °C ซึ่งสามารถตรวจพบจีโนไทป์ HPA-21a21a และ HPA-21a21b ได้ (99% และ 1%) และความเข้มข้นที่เหมาะสมของ HPA-21b control คือ 0.00018 ng สรุปผล: จากการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าวิธี PCR-SSP เป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการตรวจจีโนไทป์ของ HPA-21 ที่ง่าย สะดวก ราคาถูก ให้ผลการตรวจถูกต้องแม่นยำ สามารถนำมาใช้ในงานประจำและตรวจหาความถี่ของยืน HPA-21 ในประชากรไทยได้

Background and Objectives: Currently, 29 HPA systems have been officially nominated. HPA-21 is an important antigenic system involving platelet alloimmunity. Sever studies have reported high frequency of HPA-21b alleles in Asia. In this study, we determined an optimal concentration for a synthesized HPA-21b in order to be used as a control. Methods: Determined a suitable conditions for HPA-21 genotyping method using Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer (PCR-SSP), determined an optimal concentration of HPA-21b control, and detected genotype of HPA-21 in 100 Thai blood donors. Results: A suitable PCR condition was established. The concentrations of HPA-21 primers were 2.4 µM and for HGH were 6.4 µM. The optimal temperature for annealing was 67 °C. At this concentration and temperature, HPA021 a/a and HPA-21 a/b were found 99% and 1% respectively. The optimal concentration for HPA-21b control was 0.00018 ng. Conclusions: This study indicated that PCR-SSP was a simple, inexpensive and accurate genotyping method for HPA-21 genotyping. This protocol can be applied for routine laboratory and can be used for HPA-21 genotyping in Thai population.