การจำแนกชนิดของแมลงสาบด้วยวิธี DNA Barcodes

Abstract

การวิจัยนี้เป็นการพัฒนาวิธี DNA barcodes เพื่อนำมาใช้ในการจำแนกชนิดของแมลงสาบเปรียบเทียบกับวิธีสัณฐานวิทยาซึ่งเป็นวิธีมาตรฐาน โดยทำการจำแนกแมลงสาบจำนวน 12 ชนิด แบ่งเป็นแมลงสาบที่ทราบชนิดจำนวน 10 ชนิด และแมลงสาบที่ไม่ทราบชนิดอีก 2 ชนิด นำดีเอ็นเอที่สกัดได้จากตัวอย่างขาของแมลงสาบชนิดละ 5 ตัวอย่าง รวมทั้งสิ้น 60 ตัวอย่าง มาทำการเพิ่มจำนวนยีน COI ด้วยเทคนิค PCR โดยการใช้ LepF1 และ LepR1 primer ได้ DNA product ขนาด 700 base pairs จากนั้นนำไปหาลำดับนิวคลีโอไทด์ (sequencing) นำคลิโอไทด์ที่ได้มาทำ alignment และ phylogenetic trees โดยใช้โปรแกรม Chromas MFC Application, BioEdit, Clustal X และ MEGA 4.0 และยืนยันชนิดของแมลงสาบใน Genbank และ IBOL system พบว่าแมลงสาบที่ทราบชนิดแล้ว จำนวน 8 ชนิดได้แก่ Periplaneta americana, Periplaneta australasiae, Periplaneta brunnea, Periplaneta fuliginosa, Neostlyopyga rhombifolia, Blettella germanica, Supella longipalpa, Pycnocelus surinamensis ให้ผลสอดคล้องกันกับลักษณะทางสัณฐานวิทยา ส่วนอีก 2 ชนิดได้ แก่ Blatta lateralis, Panesthia angustipennis ให้ผลไม่สอดคล้องกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดย Blatta lateralis ให้ผลการยืนยันอยู่ในอันดับ (order) Blattaria 100% และ Panesthia angustipennis ให้ผลการยืนยันตรงกับ Periplaneta fuliginosa อาจจะเนื่องจากลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ Panesthia angustipennis และ Periplaneta fuliginosa มีความคล้ายคลึงกันมากในลักษณะภายนอก ส่วนแมลงสาบที่ไม่ทราบชนิด unknow 1 ให้ผลสอดคล้องกับอันดับ (order) Blattaria วงศ์ (family) Blattelladae และ unknown 2 ให้ผลสอดคล้องกับ Blattaria และเมื่อศึกษาความแตกต่างระหว่างสปีชีส์ของแมลงสาบ )interspecific K2P values) และความแตกต่างภายในสปีชีส์ (intraspecifics K2P value) พบว่ามีระยะห่างทางพันธุกรรม 0.097-0.268 และ 0.00-0.015 ตามลำดับ ซึ่งมีค่ามากกว่า 0.02 และไม่เกิน 0.02 ตามลำดับ จากการศึกษานี้สรุปได้ว่าวิธี DNA barcodes โดยใช้ยีน COI สามารถนำมาใช้ในการจำแนกแมลงสาบได้อย่างมีประสิทธิภาพสอดคล้องกับลักษณะทางสัณฐานวิทยา

This research aims to develop DNA barcodes method for identification of cockroaches in compared with the standard morphology method. Out of 12 species, 10 were known specis and 2 were unidentified species. DNA was extracted from cockroach legs; five samples for each species, in sum a total of 60 samples were collected. COI gene was amplified by PCR technique using LepF1 and LepR1 primer for DNA product size 700 base pairs. Then, DNA sequencing was performed, alignment and phylogenetic tress was done by using Chromas MFC Application, BioEdit, Clustal X and MEGA 4.0. Cockroach species were confirmed in Genbank and IBOL system. The study found that results from 8 species: Periplaneta americana, Periplaneta australasiae, Periplaneta brunnea, Periplaneta fuliginosa, Neostlyopyga rhombifolia, Blettella germanica, Supella longipalpa, Pycnocelus surinamensis were consistent with the morphology method while results from two species: Blatta lateralis and Panesthis angustipennis were inconsistent with the morphology method. Blatta lateralis was confirmed to be in the order Blattaris 100% and Panesthia angustipennis was resulted as Periplaneta fuliginosa. One presumption was that Panesthia angustipennis and Periplaneta fuliginosa are very similar in morphology. Unidentified species 1 is found to be in line with the order Blattaris family Blattelladae. Unidentified species 2 was consistent with Blattaria. Once studying the differences between species of cockroaches (Interspecifics K2P values) and intra-species difference (Intraspecifics K2P value), we found that the genetic distance were 0.097-0.268 and 0.00-0.015, respectively which were greater than 0.02 and less than 0.02, respectively. The study concluded that DNA barcodes using the COI gene can be used to classify cockroaches effectively and consistent with the morphology protocol.