การตรวจวิเคราะห์ Bacillus cereus ในอาหารโดยเทคนิคพีซีอาร์

Abstract

ปัจจุบันมีการนำเอาเทคนิคพีซีอาร์มาใช้ในการตรวจสอบเชื้อที่ปนเปื้อนมากับอาหารมากมาย เพื่อลดเวลาในการวิเคราะห์ และเพิ่มความแม่นยำในการตรวจสอบเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีดั้งเดิม Bacillus cereus เป็นเชื้อที่เป็นสาเหตุหลักของโรคอาหารเป็นพิษ การตรวจสอบเชื้อเบื้องต้นด้วยวิธีที่รวดเร็วและมีความแม่นยำ จะช่วยให้ผู้บริโภรคลดความเสี่ยงของการเกิดโรคท้องร่วงได้ ในการศึกษานี้ได้ทำการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์ โดยหาสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจสอบ B. cereus ที่มีความไวและจำเพาะเจาะจงต่อเชื้อก่อโรคนี้ ซึ่งไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยีนก่อโรค nheA ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ โดยความเข้มข้นต่ำสุดของไพรเมอร์ในการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ด้วยเทคนิคพีซีอาร์เท่ากับ 0.4 ไมโครไมลาร์ สำหรับอุณหภูมิของ annealing ที่เหมาะสมในการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์เท่ากับ 50 องศาเซลเซียส โดยผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของไพรเมอร์ดังกล่าว มีขนาดเท่ากับ 500 bp เมื่อทำการทดสอบความไวของเทคนิคพีซีอาร์ต่อการตรวจวิเคราะห์ยีน nhe A ของ B. cereus ในตัวอย่างอาหาร พบว่าปริมาณเชื้อต่ำสุดที่ตรวจพบเท่ากับ 35 CFU/g สำหรับการทดสอบความไวของเทคนิคพีซีอาร์ต่อการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus พบว่าปริมาณเชื้อต่ำสุดที่ตรวจพบ เท่ากับ 7.5 x 102 CFU/ml สำหรับการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ในตัวอย่างอาหารด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่ามีตัวอย่างอาหาร จำนวน 8 ตัวอย่าง จากตัวอย่างอาหารทั้งหมด จำนวน 10 ตัวอย่าง ที่มีการตรวจพบ B. cereus ซึ่งมีค่าเท่ากับ 80 เปอร์เซ็นต์ (8/10) และพบ B. cereus เท่ากับ 50 เปอร์เซ็นต์ (5/10) โดยการตรวจวิเคราะห์แบบดั้งเดิม ในการทดสอบความจำเพาะของไพร์เมอร์ของยีน nhe A ต่อ B. cereus พบว่า ไพร์เมอร์มีความจำเพาะต่อ B. cereus ถึง 100 เปอร์เซ็นต์ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า การพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์ในการศึกษาครั้งนี้ ให้ผลในการตรวจวิเคราะห์แบคทีเรียก่อโรคในตัวอย่างอาหารได้อย่างรวดเร็วและถูกต้อง ซึ่งสามารถนำไปประยุกต์ใช้ตรวจสอบ B. cereus ในตัวอย่างอาหารประเภทอื่น ๆ ได้

Presently, polymerase chain reaction (PCR) has been wildly applied to detect food contamination which is rapid assay and high accuracy when compared with conventional method. Baciilus cereus is a type bacteria that produces toxins. It is the cause of food poisoning symptom. Rapid detection with high accuracy is important step that will protect and reduce this symptom. This study aim to develop efficient PCR condition with high sensitivity and specific for detecting the B. cereus in food. The primer pairs corresponding to the non-hemolytic enterotoxin gene (nheA) was carried out for PCR assay. It was found that the minimum primer concentration required for PCR amplification of B. cereus nheA gene was found to be 0.4 uM. The optimal annealing temperature was 50 °C that could be amplified nheA is B. cereus with single band. The PCR products of these primers showed expected product size of 500 bp. The sensitivity of the developed PCR targeting nheA gene on food samples were 35 CFU/g. For the sensitivity of the developed PCR targeting nheA gene on culture were 7.5xx102 CFU/ml. The prevalence of B. cereus on food samples was 80% (8/10) for PCR and 50% (5/10) for conventional methods. The nheA primers for B. cereus detection were 100% specific. The PCR assay in this study allows rapid and accurate detection of B. cereus in food samples and has the potential to be used with other food samples.