การคัดเลือกสายพันธุ์แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์ไลเปสได้สูงและการศึกษาปัจจัยที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปสโดยใช้ของเสียจากกระบวนการผลิตน้ำมันพืชและการประยุกต์ใช้

Abstract

งานวิจัยเรื่องนี้ มีจุดประสงค์ในการศึกษาปัจจัยที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปส รวมทั้งศึกษาคุณสมบัติเฉพาะของเอนไซม์ไลเปสที่ผลิตได้จากแบคทีเรียที่คัดแยกได้จากดินและน้ำเสีย เพื่อนำมาประยุกต์ใช้ในสารซักล้าง เมื่อคัดเลือกแบคทีเรีย จ้านวน 141 ไอโซเลต โดยทดสอบการย่อยไขมันบนอาหารเพาะเชื้อ lipase test medium และอาหารเพาะเชื้อ tributyrin agar รวมทั้งวัดกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสโดยใช้ p-nitrophenyl palmitate (pNPP) เป็นสับสเตรทจากน้ำหมักที่เพาะเลี้ยงในอาหารเพาะเชื้อ Tryptic soy broth (TSB) เป็นเวลา 1 วัน พบว่ามีแบคทีเรีย จำนวน 2 ไอโซเลต ที่มีกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสสูงที่สุด คือ ไอโซเลต MUM1-5 และ POSW-1 เมื่อศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปส พบว่าแบคทีเรียไอโซเลต MUM1-5 สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสได้สูงที่สุด โดยใช้น้ำเสียจากโรงงานผลิตน้ำมันพืชแห่งที่ 1 ที่ความเข้มข้น 2 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นแหล่งคาร์บอน (216.35±0.09 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) และมีการใช้เพปโตนที่ความเข้มข้น 0.6 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นแหล่งไนโตรเจน (258.29±0.09 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) ส้าหรับอุณหภูมิและความเป็นกรด-ด่างที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปส คือ อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส (277.02±0.25 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) และพีเอช 7 (260.58±0.25 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) สำหรับแบคทีเรียไอโซเลต POSW-1 สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสได้สูงที่สุด เมื่อมีการใช้น้ำเสียจากโรงงานผลิตน้ำมันพืชแห่งที่ 1 ที่ความเข้มข้น 2 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นแหล่งคาร์บอน (235.15±0.25 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) และมีการใช้เพปโตนที่ความเข้มข้น 0.4 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นแหล่งไนโตรเจน (255.01±0.24 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) สำหรับอุณหภูมิและความเป็นกรด-ด่างที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปส คือ อุณหภูมิห้อง 35 องศาเซลเซียส (267.18±0.05 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) และพีเอช 7 (259.08±0.10 ยูนิตต่อมิลลิกรัม) ตามลำดับ จากการศึกษาคุณสมบัติเฉพาะของเอนไซม์ไลเปสจากแบคทีเรียไอโซเลต MUM1-5 พบว่า ค่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ไลเปส คือ พีเอช 10 และ อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์มีเสถียรภาพต่อความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิในช่วงกว้างระหว่างพีเอช 8-10 และอุณหภูมิ 40-55 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามลำดับ นอกจากนี้ ยังพบว่าการทำงานเอนไซม์สูงขึ้นเมื่อมี CaCl2, LiCl2, MgCl2, MnCl2 สารลดแรงตึงผิวและสารอิมัลซิฟายเออร์ โดยกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสไม่ถูกกระตุ้นเมื่อมีตัวยับยั้ง β-mercaptoethanol, DTT และ PMSF จากการศึกษาผลของตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส พบว่าเอนไซม์มีเสถียรภาพต่อเฮกเซนและเมทานอลสูงที่สุด สำหรับการทดสอบกิจกรรมและเสถียรภาพของเอนไซม์ไลเปสในสภาวะที่มีสารซักล้างชนิดผงและชนิดเหลวทั้ง 6 ชนิด ที่ความเข้มข้นของสารซักล้าง 1 เปอร์เซ็นต์ พบว่าเอนไซม์ไลเปสในเปาซิลเวอร์นาโนมีค่ากิจกรรมเอนไซม์และเสถียรภาพของเอนไซม์สูงที่สุด และในการศึกษาผลความจำเพาะของเอนไซม์ไลเปสต่อสับสเตรต พบว่าเอนไซม์ไลเปสมีความจำเพาะต่อน้ำมันมะกอก tripalmitin และ p-nitrophenyl palmitate (pNPP) สำหรับการศึกษาคุณสมบัติเฉพาะของเอนไซม์ไลเปสจากแบคทีเรียไอโซเลต POSW-1 พบว่า ค่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ไลเปส คือ พีเอช 10 และ อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์มีเสถียรภาพต่อความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิในช่วงกว้างระหว่างพีเอช 8-10 และอุณหภูมิ 40-50 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามลำดับ นอกจากนี้ ยังพบว่าการทำงานเอนไซม์สูงขึ้นเมื่อมี CaCl2, MnCl2, MgCl2, KCl, ZnCl2 สารลดแรงตึงผิว และสารอิมัลซิฟายเออร์ โดยกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสไม่ถูกกระตุ้นเมื่อมีตัวยับยั ง β-mercaptoethanol, DTT และ PMSF จากการศึกษาผลของตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส พบว่าเอนไซม์มีเสถียรภาพต่อเฮกเซนและเมทานอลสูงที่สุด สำหรับการทดสอบกิจกรรมและเสถียรภาพของเอนไซม์ไลเปสในสภาวะที่มีสารซักล้างชนิดผงและชนิดเหลวทั ง 6 ชนิด ที่ความเข้มข้นของสารซักล้าง 1 เปอร์เซ็นต์ พบว่าเอนไซม์ไลเปสในเปาซิลเวอร์นาโนมีค่ากิจกรรมเอนไซม์และเสถียรภาพของเอนไซม์สูงที่สุด และในการศึกษาผลความจำเพาะของเอนไซม์ไลเปสต่อสับสเตรต พบว่าเอนไซม์ไลเปสมีความจำเพาะต่อน้ำมันมะกอก tripalmitin และ p-nitrophenyl palmitate (pNPP) จากการทดลอบประสิทธิภาพของเอนไซม์ไลเปสในการขจัดไขมันบนผ้าฝ้าย พบว่าเอนไซม์ไลเปสที่ผลิตได้จากแบคทีเรียไอโซเลต MUM1-5 และ POSW-1 มีค่าเปอร์เซ็นต์การขจัดน้ำมันมะกอกออกจากผ้าฝ้ายสูงที่สุด เท่ากับ 94.05 และ 98.45 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ส้าหรับการจัดจำแนกแบคทีเรียโดยการวิเคราะห์ลำดับเบสของยีน 16s rRNA พบว่าแบคทีเรียไอโซเลต MUM1-5 มีความคล้ายคลึงกับ Chromobacterium violaceum ถึง 99 เปอร์เซ็นต์ และแบคทีเรียไอโซเลต POSW-1 มีความคล้ายคลึงกับ Lysinibacillus sp. ถึง 99 เปอร์เซ็นต์ ผลการทดลองเบื้องต้นที่น่าสนใจนี้ จะเป็นข้อมูลพื้นฐานที่นำไปสู่การศึกษาต่อทางด้านการท้าเอนไซม์ให้บริสุทธิ์และการนำเอนไซม์ไปสู่การประยุกต์ใช้ในระดับอุตสาหกรรมต่าง ๆ เช่น อุตสาหกรรมสารซักล้าง ในลำดับต่อไป

The focus of this study was on production and characterization of an extracellular lipase from bacteria isolated from soil and wastewater for potential application as a detergent additive. One hundred and forty-one bacterial strains were screened by oil degradation on lipase test medium and tributyrin agar. Lipase activity was measured spectrophotometrically using p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as the substrate from supernatant of Tryptic soy broth (TSB) after culturing for 1 day. Consequently, the strain MUM1-5 and POSW-1 were isolated as the good producers. The maximum lipase production from isolate MUM1-5 was obtained using wastewater from oil refining process 1 at concentration of 2% (v/v) of basal medium (216.35±0.09 U/mg) and peptone at concentration of 0.6% (v/v) of basal medium (258.29±0.09 U/mg). The optimal temperature and pH for lipase production were 45 °C (277.02±0.25 U/mg) and pH 7 (260.58±0.25 U/mg), respectively. For the maximum lipase production from isolate POSW-1 was obtained using wastewater from oil refining process 1 at concentration of 2% (v/v) of basal medium (235.15±0.25 U/mg) and peptone at concentration of 0.4% (v/v) of basal medium (255.01±0.24 U/mg). The optimal temperature and pH for lipase production were 35°C (267.18±0.05 U/mg) and pH 7 (259.08±0.10 U/mg), respectively. The optimum pH and temperature for the isolate MUM1-5 lipase activity were pH 10 and 60°C, respectively. The enzyme was stable in the pH range 8-10 and at 40-55°C for 1 h. Higher activity was observed in the presence of CaCl2, LiCl2, MgCl2, MnCl2, surfactants and emulsifiers but inhibited lipase activity by β-mercaptoethanol, DTT and PMSF. The enzyme was stable in hexane and methanol. The effect of lipase on activity and stability in the presence of power and liquid detergents of all 6 types at concentration of 1% was studied. The results showed that, the highest relative activity of lipase was observed in the presence of detergent Pao Silver Nano. Furthermore, this enzyme hydrolyzed olive oil, tripalmitin and p-nitrophenyl palmitate (pNPP). For the characterization of isolate POSW-1 lipase, the results showed that the optimum pH and temperature for enzyme activity were pH 10 and 50°C, respectively. The enzyme was stable in the pH range 8-10 and at 40-50°C for 1 h. Higher activity was observed in the presence of CaCl2, MnCl2, MgCl2, KCl, ZnCl2, surfactants and emulsifiers but inhibited lipase activity by β-mercaptoethanol, DTT and PMSF. The enzyme was stable in hexane and methanol. The results showed that, the highest relative activity of lipase was observed in the presence of detergent Pao Silver Nano and the enzyme hydrolyzed olive oil, tripalmitin and p-nitrophenyl palmitate (pNPP). The efficacy of removal of olive oil from the cotton by lipase from isolate MUM1-5 and POSW-1 were 94.05% and 98.45%, respectively. For the bacterial identification by 16s rRNA gene analysis, the results showed that isolate MUM1-5 and POSW-1 were Chromobacterium violaceum and Lysinibacillus sp., respectively with 99 percent of similarity. These promising results with enzyme preparation justify the undertaking of purification studies and the used of the purified enzyme in a more in-depth investigation for potential application as a detergent additive