การพัฒนาวิธีการตรวจจีโนไทป์ของ Human platelet antigen-12w และ 16w (HPA-12w และ HPA-16w) โดยวิธี Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer (PCR-SSP)

Abstract

Human platelet antigen (HPA) ปัจจุบันมีทั้งหมด 29 ระบบ HPA-12w และ HPA-16w เป็นระบบที่พบว่ามีความสำคัญทางคลินิกทำให้เกิดภาวะ fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) การศึกษาความถี่ของยีนระบบนี้ในประชากรไทยมีจำนวนน้อยมาก งานวิจัยนี้ได้พัฒนาวิธีการตรวจโดยทำการทดลองหาสภาวะที่เหมาะสม สำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในส่วนที่จำเพาะกับอัลลีลระบบ HPA-12w และ HPA-16w ในหลอดทดลอง โดยทดสอบหาสภาวะที่เหมาะสมของการตรวจหาจีโนไทป์ของระบบ HPA-12w และ HPA-16w ด้วยวิธี Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer (PCR-SSP) และหาความเข้มข้นที่เหมาะสมของ HPA-12b และ HPA-16b control ที่สังเคราะห์ขึ้น และตรวจหาจีโนไทป์ของระบบ HPA-12w และ HPA-16w ในตัวอย่างดีเอ็นเอของผู้บริจาคของศูนย์บริการโลหิ 100 ตัวอย่าง จากการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจหาจีโนไทป์ทั้ง 2 ระบบ พบว่าความเข้มข้นของไพรเมอร์ HPA-12w และ HPA-16w คือ 9.6 µM ของ Human Growth Hormone (HGH) คือ 6.4 µM อุณหภูมิช่วง annealing ที่เหมาะสมคือ 64 °C เมื่อตรวจจีโนไทห์ของ 2 ระบบในตัวอย่างดีเอ็นดอ 100 ตัวอย่างพบว่าเป็น HPA-12a12a และ HPA-16a16a ทั้ง 100 ตัวอย่าง (100%) และความเข้มข้นที่เหมาะสมของ HPA-12 และ HPA-16b control คือ 6.11x10[superscript-8] ng และ 1.25x10[superscript-4] ng การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าวิธี PCR-SSP เป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการตรวจจีโนไทป์ของ HPA-12w และ HPA-16w เนื่องจากเป็นวิธีที่ให้ผลการตรวจถูกต้องแม่นยำ ง่าย สะดวก และราคาถูก สามารถนำมาใช้ในงานประจำ และตรวจหาความถี่ของอัลลีลนี้ในประชากรไทยได้

Currently, 29 HPA systems have been officially nominated. HPA-12w and HPA-16w are important antigenic systems involving platelet alloimmunity, such as fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT). The studies of these systems in Thai population has few reports. In this study, PCR condition optimization was developed in order to increase numvers of HPA-12w and HPA-16w. Determined a suitable condition for HPA-12w and HPA-16w genotyping method using Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer (PCR-SSP), determined an optimal concentration of HPA-12b and HPA-16b control, and detected these genotypes in 100 Thai blood donors. A suitable PCR condition was established. The concentrations of HPA-12 and HPA-16 primers were 9.6 µM and for human Growth Hormone (HGH) were 6.4 µM. The optimal temperature for annealing was 64 °C. At this concentration and temperature, HPA-12a12a and HPA-16a16a were found 100%. The optimal concentration for HPA-12b and HPA-16b control were 6.11x10[superscript-8] ng and 1.25x10[superscript-4] ng, respectively. This study indicated that PCR-SSP was a simple, inexpensive and accurate genotyping method for HPA-12w and HPA-16w genotyping. This protocal can be applied for routine laboratory and can be used for studying these alleles in Thai population.