Utilization of vegetable oil production waste for lipase production from Pseudomonas sp. HCU2-1 and enzyme characterization

Abstract

Lipase-producing bacteria were successfully isolated and selected thorough oil contaminated wastewater and soil samples. Thirty-five bacterial strains were screened by activity on lipase test medium, and then further tested to determine their activity by using tributyrin agar. Consequently, a strain HCU2-1 was isolated as the best producer and finally identified as Pseudomonas sp. HCU2-1. Lipase production by Pseudomonas sp. HCU2-1 was optimized by varying environmental and nutritional conditions. The maximum lipase production was obtained using wastewater from palm oil refining process at concentration of 2% (v/v) of basal medium (70.29±0.09 U/mg), followed in order by wastewater from soybean oil refining process (62.59±0.38 U/mg) and crude acid oil from soybean oil refining process (62.48±0.43 U/mg), respectively. The highest lipase activity (77.14±0.33 U/mg) was obtained when peptone was used at concentration of 0.5% (v/v) of basal medium. The optimum temperature and pH for lipase production were 40°C and pH 7, respectively. Zymogram assay of crude enzyme on SDS-PAGE presented one band with lipase activity of molecular weight of 45 kDa. The optimum pH and temperature for activity were pH 11 and 60°C, respectively. The enzyme was stable in the pH range 9-11 for 60 min and at 40-60°C for 60 min. Higher activity was observed in the presence of surfactants, Ca²*, Mg2+, Mn2+ ions and strongly inhibited lipase activity by DTT and PMSF. Furthermore, this enzyme hydrolyzed synthetic triglycerides and ester of pNPP. The enzyme exhibited significant stability in the presence of commercial detergents and oxidizing agents. Hence, lipase from Pseudomonas sp. HCU2-1 could be considered to be suitable for a variety of industrial applications such as in detergent formulations.

การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์ไลเปสประสบความสำเร็จ โดยทำการคัดแยกเชื้อจาก ตัวอย่างน้ำเสียและดินที่ปนเปื้อนน้ำมัน แบคทีเรียจำนวน 35 ไอโซเลต จะถูกคัดเลือกโดยทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์ ไลเปสบนอาหารเพาะเชื้อ lipase test medium และทำการทดสอบอีกครั้งบนอาหารเพาะเชื้อ tributyrin agar ผลจาก การทดสอบพบว่าแบคทีเรียไอโซเลตที่ให้ผลผลิตของเอนไซม์ไลเปสดีที่สุด คือ แบคทีเรียไอโซเลต HCU2-1 และจากการจัด จำแนกเชื้อ พบว่าคือ Pseudomonas sp. สำหรับการศึกษาการผลิตเอนไซม์ไลเปสจาก Pseudomonas sp. HCU2-1 ຈະ ทำการศึกษาโดยปรับเปลี่ยนสภาวะแวดล้อมและแหล่งอาหารต่าง ๆ ให้เหมาะสมซึ่งพบว่า เชื้อสามารถผลิตเอนไซม์ไลเปส ได้มากที่สุดเมื่อมีการใช้น้ำเสียจากกระบวนการกลั่นน้ำมันปาล์มที่ความเข้มข้น 2% (v/v) ของอาหารเพาะเชื้อ basal medium (70.29±0.09 U/mg) ลำดับถัดมา คือ น้ำเสียจากกระบวนการกลั่นน้ำมันถั่วเหลือง (62.59+0.38 U/mg) และ crude acid oil จากกระบวนการกลั่นน้ำมันถั่วเหลือง (62.48±0.43 U/mg) ตามลำดับ กิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสมีค่า สูงสุด (77.14±0.33 U/mg) เมื่อมีการใช้เพปโตนที่ความเข้มข้น 0.5% ( /) ของอาหารเพาะเชื้อ basal medium สำหรับ อุณหภูมิและความเป็นกรด-ด่างที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปสคือ อุณหภูมิ 40°C และpH 7 ตามลำดับ ในการทดสอบ กิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสบน SDS-PAGE ปรากฏแถบโปรตีนขนาด 45 kDa จำนวน 1 แถบ ที่แสดงถึงกิจกรรมของ เอนไซม์ไลเปส สำหรับการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ไลเปสพบว่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเกิด ปฏิกิริยาของเอนไซม์ คือ pH 11 และอุณหภูมิ 60°C ตามลำดับ เอนไซม์ไลเปสมีเสถียรภาพต่อความเป็นกรด-ด่างและ อุณหภูมิในช่วงกว้างระหว่าง pH 9-11 เป็นเวลา 60 นาที และอุณหภูมิ 40-60°C เป็นเวลา 60 นาที และยังพบว่าการทำงาน ของเอนไซม์สูงขึ้นเมื่อมีสารลดแรงตึงผิว Cact, MgC และ MnCL แต่กิจกรรมของเอนไซม์จะถูกยับยั้งโดย DTT และ PMSF เอนไซม์สามารถย่อยสลาย tripalmitin และ PNPP ได้ดี เอนไซม์ยังคงมีเสถียรภาพสูงต่อสารซักล้างทางการค้าและ oxidizing agents ผลการทดลองเบื้องต้นที่น่าสนใจนี้แสดงให้เห็นว่า เอนไซม์ไลเปสจาก Pseudomonas sp. HCU2-1 สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมต่าง ๆ เช่น อุตสาหกรรมสารซักล้างได้